Ništa na ovom Svijetu nije u tako kratkom vremenu promijenilo živote toliko ljudi kao PCR test za kojeg neki tvrde da je pogodan i za otkrivanje živih virusa i za davanje dijagnoze. Dapače neki idu još dalje pa na temelju tog testa čak određuju uzrok smrti. Stoga sam ja odlučio pisati o tome testu koji je umnogome promijenio naš život. Pisati ću na način da i ljudi koji nisu stručnjaci, dapače da i ljudi koji imaju završenu samo osnovnu školu mogu razumjeti. Zbog toga tekst mora biti širok i detaljan, a što nažalost znači i dug. Ali taj test vam može promijeniti život pa vam preporučam da ustrajete s čitanjem teksta do kraja.

PCR je osmišljen kako bi od vrlo male količine genetskog materijala napravio puno više. Zbog toga da bi razumjeli PCR test trebamo znati osnove genetskog materijala.

Genetski materijal se sastoji od četiri različite baze Ademin, timin, citozin i guanin. Po prvom slovu njihovog imena skraćenice su im A, T, C i G. Cijeli genetski materijal se sastoji od slijeda puno takvih baza. Predstavlja se da ljudi imaju slijed od oko 4*10^9, a corona virus slijed od samo oko 30 000 takvih baza. Još jedna važna razlika je što se ljudski genetski niz sastoji od dvostrukog lanca komplemetarnih baza i to DNA a kod korona virusa je samo jednostruki lanac i to RNA. Komplementarne baze su A i T te C i G koje se zbog različitih vodikovih veza međusobno vežu pa se zato i nazivaju komplementarnima. Kod RNA se umjesto, kao što se slici može vidjeti,  Timina nalazi malo promijenjena baza Uracil.

Te 4 baze služe kao kod za izradu proteina. Međutim, aminokiselina koje grade proteina imamo 20. Pa se postavlja pitanje kako 4 različite baze mogu šifrirati 20 različitih aminokiselina. Pa tako što ćemo očito trebati neki dulji niz baza, a ne samo jednu. Slijed od 1 baze može dati 4 različita koda (A, T, C, G) ali zato slijed od dvije baze može dati 16 različitih kombinacija (AA, AT, AC, AG, TT, TA, TC, TG, CC, CA, CT, CG, GG, GA, GT,GC). Ali ni to nije dovoljno da bi kodiralo 20 različitih aminokiselina. Ali zato slijed od 3 baze može dati 4^3=64 različitih kombinacija. To je mnogo više kombinacija od 20 potrebnih za različite aminokiseline plus Start i Stop kod. Zbog toga više različitih kodova kodira istu aminokiselinu. Koga zanima na slici može vidjeti koji kodovi odgovaraju kojoj aminokiselini.

Sada smo vidjeli kako genetski kod kodira aminokiseline koje su osnovne građevne jedinice proteina. Kako bi mogli obavljati svoju funkciju proteini se sastoji od mnogo različitih aminokiselina. Funkcija proteina je izgradanja stanice te obavljanje rada. Oni proteini koji ne sudjeluju u izgradnji stanice i njenih struktura su u biti nano roboti koji obavljaju rad u stanici.

Virusi su najjednostavniji biološki entitet. Oni nemaju jezgru. Oni se sastoje od genetskog materijala obavijenog membranom. Na slici je prikazan Sars-Cov-2 virus sa proteinima koje šifrira RNA koja se nalazi unutar membrane.

U tih 30 000 baza SARS-COV-2 virus kodira Spike protein, Hemagglutinin esterase, membranski protein i envelope protein. U ovom članku https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7161481/  , objavljenom 19.6., možete vidjeti koliko baza(nukleotida(nt)) kodira koji od gore navedenih proteina.

S gen, koji kodira spike protein ima 3822 nukleotida(baza), E gen samo 228, a N gen 908. To su svi podaci koji će nam trebati o virusu zbog kojeg su vam neki odlučili promijeniti život.

A sada ćemo opisati PCR tehniku. Na ovom videu je lijepo objašnjena PCR tehnika https://jubitu.com/videos/watch/a81edc45-cbb2-4838-8026-28d6fea8443e

Možemo ju podijeliti u 3 djela: prikupljanje uzorka, priprema uzorka te umnožavanje genetskog materijala i detekcija kratkog slijeda baza. Prikupljanje uzorka je najosjetljiviji dio te samim time treba mnogo iskustva kako bi se uzorak ispravno prikupio, tj. kako rezultati PCR testa ne bi ovisili o načinu prikupljanja uzorka. Nakon toga tako prikupljene uzorke je potrebno obraditi da način da u njima ostane samo genetski materijal. Ako pretpostavimo da je u uzorcima bio cijeli virus, to znači da treba razoriti njegovu ovojnicu, pročistiti sve te krhotine kako bi se ekstrahirao samo genetski materijal. U zadnjem koraku se taj genetski materijal umnožava.

Zadnji, treći korak, umnožavanje i detekcija kratkog slijeda baza se odvija na slijedeći način. U epicu (mala posuda) u kojoj se nalazi RNA se doda reverzna transkriptaza i DNA polimeraza (to su 2 nano proteinska robota),  forward i reverse primer, te proba koja na sebi ima molekulsku boju i na drugom kraju quencher, te mnoštvo nukleotida. U prvom koraku se od RNA napravi komplementarna DNA na način da se reversni primer veže na RNA na mjesto na koje će potom doći reversna transkriptaza (nano robot) i sintetizirati drugi lanac iz nukleotida koji se nalaze u otopini. Nakon toga se temperatura povećava do 95 stupnjeva Celzijusa kako bi se takva dvolančana RNA denaturirala u dvije jednolančane te u isto vrijeme deaktivirala reversna transkriptaza i aktivirala DNA polimeraza. Nakon toga na te dvije jednolanačne RNA vežu se forward  i reverse primeri te proba sa bojom. DNA polimeraze (nano proteinski roboti) dolaze na mjesto gdje se primer vezao i sintetiziraju drugi lanac. Tijekom sinteze sa probe otkače molekulsku boju i quencher. I tako nakon prvog koraka od dvije jednolančane RNA imam dvije DVOLANČANE RNA, te jedan par molekularne boje i quenchera koji nisu spojeni, tj. nalaze se negdje u otopini na velikoj udaljenosti. Ova procedura se ponavlja mnogo puta i tako se u svakom koraku dobije duplo više dvolančane RNA i duplo više molekularnih boja koje su udaljene od svojih quenchera.

Molekularna boja kada je pobuđena svijetlom emitira svijetlo malo niže frekvencije od one kojom je pobuđena. Međutim, molekularna boja ne emitira svijetlo ako se u blizini nje nalazi quencher. Tako da tek kada se quencher udalji od molekularne boje ona može emitira svjetlo. Bilježenjem intenziteta tog svijetla se može odrediti da li se u epici nalazi genetski materijal na kojeg su se vezali primeri i proba.

Sijed baza forward i reverse primera i proba koji CDC predlaže za test na SARS-Cov-2 možete vidjeti na njihovim stranicama https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html

Sekvence

Iz cijele ove tablice glavni podatak koji bi trebalo zapamtiti je da i forward i reverse primere i boje (probe) se sastoje od samo otprilike dvadesetak nukleotida.

Sada možemo zaključiti što u biti PCR tehnika detektira. PCR tehnika ne detektira kompletan, funkcionalan virus nego samo fragmente genetskog materijala. I to od 2×30 000 baza genetskog materijala dovoljno je samo dvadesetak baza reverse primera i dvadesetak baza boje te na drugom lancu samo dvadesetak baza forward primera da bi dobili pozitivan signal. Znači od 30 000 baza genetskog materijala na temelju samo 60 baza može se dobiti pozitivan odgovor. To je samo 0.2% cjelokupnog genetskog materijala Sars-cov-2 virusa.

Sada ćemo navesti samo neke načine kako tako mala specifičnost testa može dovesti do lažno pozitivnog rezultata.

1. U uvodu članka objavljenog 2012 godine https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625711001908 napisano je:“ Viral metagenomic analyses of environmental samples suggest that the field of virology has explored less than 1% of the extant viral diversity… One L of seawater can contain as many as 10¹⁰ virus-like particles (VLPs) [1], approximately 10 times more than the number of prokaryotes. Terrestrial environments often have 10⁹ VLPs per gram. By extrapolation from the estimated number of prokaryotes in different environments [2], viruses are the most abundant entities in the biosphere totaling an estimated number of 1.2 × 10³⁰, 2.6 × 10³⁰, 3.5 × 10³¹, and 0.25–2.5 × 10³¹ in the open ocean, in soil and in oceanic and terrestrial subsurfaces, respectively… While no VLPs could be detected in the earliest infant stool samples, there were ∼10⁸ virus particles per gram wet weight of feces by the end of the first week.“U članku, objavljenom 2014 godine https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147198/ piše:“ There are some amounts of the virus in the air constantly. These amounts is generally not enough to cause disease in people, due to infection prevention by healthy immune systems.“Iz ta dva rada možemo izvući jako puno, ali ja ću navesti samo ono najznačajnije za PCR testove. U 1 litri morske vode nalazi se 10¹⁰ čestica nalik virusima (to je više nego ljudi na zemlji). Svaka od tih čestica sadrži genetski materijal.  Virusi se konstantno nalaze u i zraku. Osim toga procjenjuje se da je virologija otkrila manje od 1% virusa.Kada znamo te činjenice postavlja se pitanje kako se uzorci za PCR analizu štite od kontaminacije?Tvrtke koje proizvode mikro čipove su osmislile kompleksne sustave, čiste sobe (eng. cleanroom) kako da osiguraju da im mikroskopske čestice ne unište čip tijekom proizvodnje. Na ovom filmu možete vidjeti kako izgleda njihovo rješenje za uklanjanje sub mikroskopskih čestica.https://jubitu.com/videos/watch/c0109516-68cf-40e0-9592-d37987592109I tu je prikazan samo prvi stupanj sustava koji osigurava sub mikroskopsku čistoću. Taj sustav služi da bi dovoljno očistio zrak kako bi drugi stupanj koji ga još više pročisti mogao funkcionirati. Drugi dio sustava se sastoji od kontejnera u kojem se transportiraju čipovi. Oni su u potpunosti bez sub mikroskopskih čestica.Nakon ovoga postavlja se pitanje kako oni koji uzimaju uzorke za PCR analizu osiguravaju da se uzorak ne kontaminiraju? Oni uzorke uzimaju na parkiralištu a da osoba uopće ne treba izaći iz automobila dok se uzorka uzima? Cijelu pripremu uzoraka prije stavljanja u PCR mašinu rade u labosima koji nemaju čistoći čiste sobe za proizvodnju čipova? Kada bi se tak moglo osigurati da se uzorka ne kontaminira submikronskim česticama onda bi tako radili i proizvođači mikro čipova i uštedjeli bi značajno svoj proizvodni proces a samim time i svoj proizvod.Iz toga možemo zaključiti da nije isključeno da PCR test bude pozitivan zato što se uzorak kontaminirao sa genetskim materijalom iz zraka sa nekim od 99% virusa koji još nisu otkriveni a koji imaju 60-tak baza koje ima i tast za Sars-cov-2.
2. Do danas je otkriveno 111 porodica virusa. Od tih 111 porodica 25 je pronađeno u ljudima. U samo tih 25 porodica pretpostavlja se da se u sisavcima i pticama nalazi neotkrivenih 1.67 milijuna virusa. Global virome project si je dao za zadatak da katalogizira te dosad neotkrivene viruse. https://science.sciencemag.org/content/359/6378/872.full Ako je toliko puno virusa u sisavcima neotkriveno i ne znamo njihov genetski kod kako možemo biti sigurni da on ne sadrži onih 60 baza koje traži PCR test kod detekcije Sars-cov-2?

3. In the human holobiont, the 10¹³ human cells are outnumbered 10-fold by bacteria and 100-fold by viruses. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625711001908It has been estimated that there are over 380 trillion virusesinhabiting us, a community collectively known as the human virome.https://www.inverse.com/article/49747-what-is-the-human-viromeU prosječnom čovjeku nalazi se 10 puta više bakterija i 100 puta više virusa nego ljudskih stanica. Procjenjuje se da se u prosječnom čovjeku nalazi 0.4*10^15 virusa. To je otprilike 100 000 puta više nego što je trenutno ljudi na planeti. Kako je netko isključio da niti jedan od 0.4*10^15 virusa i niti jedna od 0.4*10^14 bakterija nema tih 60-tak baza koje se koriste u testa za Sars-Cov-2 kada još uvijek ne znamo slijed baza svih tih virusa i bakterija?

4. Although the human genome has been completely sequenced for some practical purposes, there are still hundreds of gaps in the sequence and an uncertainty of about 5–10% (300 million basepairs added in 2018).^[26] A study, published in 2015, noted more than 160 euchromatic gaps of which 50 gaps were closed.^[27] However, there are still numerous gaps in the heterochromatic parts of the genome which is much harder to sequence due to numerous repeats and other intractable sequence features. https://en.wikipedia.org/wiki/Human_genomeIako su neki proglasili da smo u potpunosti sekvencirali genom jednog čovjeka to nije točno. U njegovoj sekvenci još uvijek postoji mnoge praznine. Samo je u 2018 nadodano 300 miliona parova baza. Na koji način netko može osigurati da 60-tak baza na koje se vrši test nisu i negdje i u još uvijek ne sekvenciranom dijelu DNA tog čovjeka? Osim toga svaki čovjek ima drugačiju DNA. Pa čak i ako taj jedan čovjek kojem još nismo do kraja sekvencirali DNA ne posjeduje tih 60-tak baza, kako možemo biti sigurni da drugi ljudi čiji genom nismo sekvencirali nemaju tih 60-tak baza u svom genomu.
5. Čak i da se doista genetski materijal virusa nalazi na štapiću za uzimanje brisa postavlja se pitanje da li je on došao iz osobe kojoj je bris uzet ili iz zraka? Kada je proglašena panedmija i obaveza nošenja maski možemo pretpostaviti da tog virusa u zraku ima u izobilju. A to znači da se virus na štapić za bris mogao zakačiti dok se taj štapić nalazio na zraku.
6. PCR test detektira fragmente genetskog materijala a ne prisustvo cijelog virusa. Tako da čak i da je test ispravno pozitivan i da je genetski materijal došao iz brisa pacijenta to još ne znači da je taj virus bio funkcionalan u pacijentu. Možda je imuni sustav pacijenta neutralizirao virus i sada se fragmenti tog virusa nalaze u tom zdravom čovjeku te ih on putem sekreta izbacuje van.
7. Na pakiranju seta za testiranje i sam CDC kaže da oni ne mogu osigurati da primeri stvarno i imaju tu sekvencu koju su naveli:“ Every effort has  been made to assure the accuracy of the sequences, but CDC cannot provide any warranty regarding their accuracy. „https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.htmlZbog toga je upitno i ono što smo do sada uzimali da nije. Upitna je sekvenca primera koju ste dobili kada ste kupili set za testiranje.
8. U svojoj objavio Srečko Sladoljev je opisao kako je Imunološki zavod za testiranje prisustva virusa hepatitisa C metodom PCR vršio validaciju 3 godine. https://www.facebook.com/sladoljev.srecko/posts/3314283395268576 Te tri godine su u Imunološkom zavodu stalno dobivali pozitivni rezultat na prisustvo virusa hepatitisa C u doniranoj krvi za proizvodnju interferona. Tri godine je trajala validacija testa i 3 godine su dobivani lažno pozitivan rezultat. To govori o tome koliko je i samo uzimanje uzoraka podložno davanju lažno pozitivnih rezultata. Kao kuriozitet navodim da je tada dr. Markotić bila voditeljica kontrole interferona. U 3 godine dr. Markotić nije uspjela napraviti da test na hepatitis C iz krvi, ne daje lažno pozitivne rezultate, a sada bi trebali vjerovati da je u par mjeseci dr. Markotić uspjela validirati test na Sars-Cov-2 u ljudi, što je mnogo kompliciraniji test nego test na hepatitis C iz krvi, i da test ne daje lažno pozitivne rezultate?
9. Moglo bi se još mnogo točaka napisati koji govore o (ne) točnosti PCR testa da detektira virus ali zaustaviti ću se i dati viđenje čovjeka koji je izmislio PCR test Kary Mullisa i za to dobio nobelovu nagradu:“ In the early 1990’s, PCR, came into popular use, and Kary Mullis was awarded the Nobel Prize for it in 1993.  PCR, simply put, is a thermal cycling method used to make up to billions of copies of a specific DNA sample, making it large enough to study. PCR is an indispensable technique with a broad variety of applications including biomedical research and criminal forensics.” According to Mullis himself, PCR cannot be totally and should never be used as a tool in “the diagnosis of infectious diseases.”Izumitelj PCR metode kaže da se PCR ne bi trebao nikada koristiti u dijagnozi zaraznih bolesti.https://www.weblyf.com/2020/05/coronavirus-the-truth-about-pcr-test-kit-from-the-inventor-and-other-experts/?fbclid=IwAR3hd9p7H–k61uWZyvJ4VyvebGm8vp5p6rhnukUIOxWFBWywz48CrGFCWM

Gospodo koji zatvarate građane na temelju tog testa, da li mislite da je neka od ovih 9 točaka uzrok što su građani pozitivni na taj test po 60 dana bez da imaju ikakve simptome I da nisu zarazni, ali su ipak u kućnom pritvoru. Da li možda na temelju lošeg testa vi zatvara sugrađane?

Danijel GRGIČIN/Logicno.com